Miyake et al. 2020 FEBS J. 論文のあれやこれや
オンライン掲載からだいぶ日が経ってしまいましたが、三宅くんが筆頭のFEBS J. の論文についても、非常に思い入れが強いので、経緯についてまとめたいと思います。
FEBS J. オンライン版 「Functional diversification of two bilin reductases for light perception and harvesting in unique cyanobacterium Acaryochloris marina MBIC 11017」
この論文の経緯については、2019年のPNAS論文の経緯を綴ったコラムと前半は被りますので、そちらを事前に読んでもらってから、こちらを読んでくれると幸いです。
あちらのコラムには、アカリオクロリスには他のシアノバクテリアよりも長波長の光質を感知する光受容体・シアノバクテリオクロムが存在する可能性を着想し、他の生物由来のシアノバクテリオクロムの主要結合色素・フィコシアノビリン（PCB）の前駆体であり、より長波長の光質を吸収できるビリベルジン（BV）に着目したという経緯が記載されています。そして、まずはPCB産生大腸菌とBV産生大腸菌でアカリオクロリス由来のシアノバクテリオクロムを発現し、精製タンパク質を分析したことを綴っていますが、実は、PCB産生大腸菌での結果において、この研究に繋がる最初の萌芽が生まれました。赤色光と緑色光の間で可逆的な光変換を示すXRG型シアノバクテリオクロムのホモログを、PCB産生大腸菌で発現させわけですが、その多くは、当初の予想通りPCBを結合し、赤色光と緑色光で変換すという性質を示しました（下図）。その際、AnPixJg2という、僕がシアノバクテリオクロムとして最初にターゲットとした分子をコントロールとして（Narikawa et al. 2008 JMB）、実験を進めていたわけですが、これと比較すると、赤色光吸収型の長波長側に小さな吸収の肩があることに気づきました。しかし、メインの光変換は基本的に同じでしたし、この実験のメインテーマはBVを結合できるかどうかだったので、まずはその小さな肩の追求は後回しにして、BV結合型の分析と論文化を進めました（Narikawa et al. 2015 Sci. Rep., Narikawa et al. 2015 BBRC, Fushimi et al. 2016 Front. Microbiol.）。
それらの解析が落ち着いた後に、件の「吸収の肩」に向き合うことにしました。この肩吸収が何に由来するかを確かめるために、まずは下図左下の実戦のように赤色光照射によりPCB結合型分子を緑色光吸収型のみにして、長波長の肩の部分の吸収がしっかり見えるようにします。この状態で、700 nmの光を照射すると、この吸収がなくなり、その代わり、短波長の吸収が上がりました（下図左下の点線）。これは、この吸収が何らかの光変換する分子に由来することが分かります。そこで、光照射前後の差スペクトルを計算すると、PCB結合型よりも両方の吸収型が長波長シフトした成分であることが分かりました（下図右下、黒線：PCB結合型、青線：長波長成分）。この分子は、PCB産生大腸菌で発現して精製したものなのですが、PCB産生大腸菌は、前駆体であるBVも同時に産生しており、以前のコラムでも記したように、BVの方がPCBよりも長波長の光質を吸収しますので、この成分がBVの結合に依るものである可能性が高いと考えました。そこで、同時にBVのみを産生する大腸菌から同じ分子を精製して、その光変換も測定していたので（下図右上）、その差スペクトルと比較することにしました（下図右下）。その結果、この長波長成分（下図右下、青線）は、BV結合型（赤線）の差スペクトルとは明らかに異なっており、BV結合型とPCB結合型のちょうど中間的な光質を吸収することが分かりました。つまり、この長波長成分はPCBでもBVでもない何かが結合した分子に由来することが強く示唆されました。
それでは、一体、どんな色素が結合しているのでしょうか？実は、BVを還元してPCBを産生するPcyAという酵素は、二段階で色素を還元し、ジヒドロビリベルジン（DHBV）という色素を中間体として産生しているのです（右図）。そして、二段階の還元の一方の還元だけが行われた色素なので、DHBVはBVとPCBの中間的な光質を吸収する性質を持っており、この長波長成分と整合する可能性が非常に高いと考えました。PcyAは結合したBVを連続的に還元して、PCBを産生するはずなので、DHBVはフリーの色素としてはほとんど存在しないはずです。それにもかかわらず、このようにDHBVを結合したと思われる成分が検出できたことから、アカリオクロリス由来の分子のDHBVに対する親和性は非常に高く、アカリオクロリス生体内における本来の結合色素は、実はDHBVなのではないか！？という仮説に至りました。
この段に至り、まずはアカリオクロリスにおけるPcyAホモログを探索することにしました。その結果、非常に興味深いことに、他のシアノバクテリアにおいては、PcyA遺伝子は1コピーしかないにもかかわらず、アカリオクロリスには例外的にPcyA遺伝子が2コピーあることが分かりました（下図の赤字）。さらに、アカリオクロリスにはメイン染色体に加えて、多くのプラスミドが存在するのですが、片方はメイン染色体、もう片方は特定のプラスミドにコードされていました。興味深いことに、メイン染色体にはシアノバクテリオクロムの多くがコードされている一方で、プラスミドにはPCBを結合して光感知ではなく光合成の光捕集に関与するフィコビリソームという複合体をコードする遺伝子群がコードされていました。つまり、メイン染色体のPcyA（AmPcyAc, AM1_5311）は光受容体に色素を供給し、プラスミドのPcyA（AmPcyAp, AM1_C0185）は光捕集フィコビリソームに色素を供給するように機能分化している可能性が考えられました。フィコビリソームは、光合成の反応中心が吸収できない橙色の短波長の光質を吸収し、そのエネルギーを光合成反応中心に受け渡す役割を持ちます。そのことから、フィコビリソームに色素を供給するプラスミドにコードされたAmPcyApは、短波長の光質を吸収するPCBのみを供給するように機能分化し、その一方で、光受容体に色素を供給するメイン染色体にコードされたAmPcyAcは、長波長の光質を感知する光受容体に長波長の光質を吸収できるDHBVを供給するように機能分化している可能性を着想しました。
これを証明するために、まずは大腸菌での共発現系の構築から始めました。今まで、PCBを産生する大腸菌は、モデルシアノバクテリアであるSynechocystis由来のHO1とPcyA（SyPcyA）という酵素を発現するプラスミドが入ったものとなっており、前者がヘムからBVを合成し、後者がBVからPCBを合成します。そこで、SyPcyAの領域をAmPcyApとAmPcyAcにそれぞれ置き換えたプラスミドを作製し、それとアカリオクロリス由来の光受容体との共発現を行い、光受容体を精製しました。その結果、AmPcyApと共発現した分子のスペクトルでは、全く長波長成分の吸収が確認できなかったのに対して、AmPcyAcと共発現した分子のスペクトルでは、長波長成分の吸収が極めて大きいものが得られました。当初の予想では、長波長由来の成分しか得られないことを期待していたのですが、そうはなりませんでした。これについては、まだ色々な解釈があるのですが、大腸菌の中での再構成によるアーティファクトを含んでいると考えていて、今後の検討課題です。ただし、アカリオクロリスの光受容体の中には、PCBのみを結合する分子も報告されているため、PcyAとしては、DHBVだけでなく、PCBも供給する必要があると考えられ、その意味では、この結果はリーズナブルであると言えます。ここまでは、僕が駒場にいる間に取得できたデータなのですが、この後、しばらくはこの研究はお蔵入りすることになります。
静岡大学に異動した最初の一年は、学生さんを受け入れておらず、特任助教さん（当時の立場は研究員さん）との二人三脚でしたので、このテーマに取り掛かる余裕はありませんでした。さらに、一期生は3人配属されたのですが、他のテーマが優先されて、このテーマはさらに一年間塩漬けされることになりました。このように、二年間、研究は止まっていたのですが、二期生として配属された三宅くんがこのテーマを遂行することになり、ようやく止まった研究が動き出したのです。これまでは、大腸菌の中での共発現という、いわば間接的な方法で色素の蓄積を検証していたわけですが、これではきちんとしたことは言えないので、PcyAの活性をしっかりと測定する必要があります。そのために、まずはPcyAを精製し、その活性を測定する実験系を構築しなければいけません。僕自身はこれまで酵素活性を測定する実験はほとんど行ったことがなく、完全な手探り状態で実験を進めることになりました。さらに、色素の分析にもHPLCを使った分離法を確立する必要があり、色々と壁が多かったのです。特にPcyAの酵素活性測定系は非常に難易度が高いのです。というのは、PcyAは単独で酵素活性を発揮するのではなく、フェレドキシンという分子から還元力を供給してもらう必要があり、かつ、そのフェレドキシンをリサイクルするためにはNADPHやFNRといった分子群も加えなくてはいけません。さらに、この反応系は嫌気状態でないと進行しません。これらの点をクリアすべく、先行研究の文献を漁り、実際に活性測定をしているラボを訪問し、嫌気状態を作るために、隣の学科のシステムを借りにいき、といった様々なタスクを三宅くんが辛抱強く遂行してくれたおかげで、活性を測定できない日々が半年近く続いたものの、ようやく活性を検出することに成功したのです。その後も、測定系を改善するなどにとても時間がかかりましたが、結果として、AmPcyApの反応においては、DHBVの蓄積が非常に短く一過的であったのに対して、AmPcyAcの反応においては、DHBVが長時間蓄積し、DHBVが残った状態で反応が飽和するという結果が得られました。これは、僕が共発現系で得た結果と合致するものであり、やはり、二つのPcyAはDHBVの蓄積という点で、高度に機能分化していることを証明することができたのです。さらに、その後、DHBVを精製し光受容体のアポ体と再構成したり、フィコビリソームの構成分子との共発現系を試みて、こちらに対してはPCBのみが特異的に結合することを見出したり、という実験を三宅くんが丁寧に行い、論理の穴を埋めることができました。最終的なストーリーとしては、下図が分かりやすいかと思います。
アカリオクロリスにおける形質転換系が未だしっかりとは確立していないこともあり、生体内で本当にどの色素が結合しているかどうかについては、答えを出すことはできませんでしたが、丁寧な生化学実験により、面白い研究を展開できたと自負しています。生体内でのことにしっかりと言及できなかったので、generalな雑誌に掲載することはできませんでしたが、きちんとした専門誌への掲載に至ったことはとても嬉しく思っています。三宅くんは今もこれに続く研究を継続しているので、続報を出せるように引き続き頑張ります。今回の実験では、全く予期しない、かつ、見過ごしてもおかしくないような小さい吸収の肩に着目したことで、こちらが予期しないストーリーを探り当てることができという「セレンディピティ」に当てはまる事案になるのではないかと思っています。今後も、自分の想定しないデータが出た時に、それとしっかりと向き合い、背後に潜む謎に切り込むことのできる研究を展開できればと思います。
